種子作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的“芯片”，其純度直接決定作物群體的一致性、抗逆性及最終產(chǎn)量。據(jù)《中華人民共和國(guó)種子法》規(guī)定，主要農(nóng)作物種子純度需達(dá)到96%以上（常規(guī)種）或98%以上（雜交種），但生產(chǎn)中因機(jī)械混雜、生物學(xué)混雜等問(wèn)題，雜質(zhì)種子混入常導(dǎo)致純度不達(dá)標(biāo)，每年給我國(guó)農(nóng)業(yè)造成數(shù)十億元經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立高效、精準(zhǔn)的種子純度鑒定技術(shù)，是保障種業(yè)安全與農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的核心需求。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、種子樣品

水稻品種“南粳46”（純合樣品，純度99.9%）及雜質(zhì)種子（“南粳5055”）；

玉米品種“鄭單958”（純合樣品，純度99.9%）及雜質(zhì)種子（“先玉335”）；

2、主要儀器

熒光定量PCR儀；納米滴分光光度計(jì)；高速離心機(jī)；超凈工作臺(tái)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、種子基因組DNA提取

取單粒種子，去殼后研磨成粉末，稱取10mg粉末加入200μL裂解液（試劑盒配套），65℃水浴30min；

加入200μL氯仿，渦旋混勻后12000rpm離心10min，取上清液；

按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入吸附柱、洗滌液，最終用50μL洗脫液洗脫DNA；

用納米滴分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度，1%瓊脂糖電泳驗(yàn)證DNA完整性。

2、特異性驗(yàn)證

分別以“南粳46”、“南粳5055”、“鄭單958”、“先玉335”的基因組DNA為模板，采用優(yōu)化的qPCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熔解曲線（單一峰為特異性擴(kuò)增）和熒光信號(hào)值（非目標(biāo)品種無(wú)熒光信號(hào)）驗(yàn)證引物探針的特異性。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建與靈敏度分析

制備“南粳46”雜質(zhì)梯度樣品：將“南粳5055”（雜質(zhì)）與“南粳46”（純合）種子按質(zhì)量比混合，制備雜質(zhì)含量為0.1%、0.5%、1%、5%、10%的樣品，每個(gè)梯度3次重復(fù)；

提取各梯度樣品的混合DNA（每個(gè)樣品提取3次，取平均值）；

以各梯度DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，記錄Ct值，以雜質(zhì)含量的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擴(kuò)增效率；

4、實(shí)際樣品純度檢測(cè)與準(zhǔn)確性驗(yàn)證

隨機(jī)選取3批“南粳46”商品種子和3批“鄭單958”商品種子；

每批樣品隨機(jī)取100粒種子，提取混合DNA，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算純度；

同時(shí)采用傳統(tǒng)SSR-PCR電泳法進(jìn)行純度檢測(cè)，以電泳法結(jié)果為對(duì)照，計(jì)算qPCR檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差。

5、穩(wěn)定性與重復(fù)性驗(yàn)證

批內(nèi)重復(fù)性：選取“南粳46”1% 雜質(zhì)樣品，在同一批次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行8次平行qPCR擴(kuò)增，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)；

批間重復(fù)性：同一“南粳46”1% 雜質(zhì)樣品，在3個(gè)不同日期（間隔7d）進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每次3次重復(fù)，計(jì)算總CV值。

二、結(jié)果與分析

（一）DNA提取質(zhì)量

所有種子樣品的DNA提取結(jié)果顯示，OD???/OD???均在1.82-1.95之間，瓊脂糖電泳呈現(xiàn)單一明亮條帶（無(wú)彌散），表明DNA純度與完整性符合qPCR實(shí)驗(yàn)要求，無(wú)抑制劑殘留影響擴(kuò)增效率。

（二）特異性驗(yàn)證結(jié)果

熔解曲線分析顯示，僅“南粳46”模板在60℃左右出現(xiàn)單一特異性峰，“南粳5055”、“鄭單958”、“先玉335”模板均無(wú)明顯熒光峰（熒光信號(hào)值<100）；熒光信號(hào)圖顯示，非目標(biāo)品種的Ct值均大于38（視為陰性），證明引物探針特異性良好，無(wú)交叉反應(yīng)，可準(zhǔn)確區(qū)分目標(biāo)品種與雜質(zhì)品種。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

以“南粳46”雜質(zhì)梯度樣品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Ct=-3.42lgC+35.68，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，擴(kuò)增效率E=96.5%（符合90%-110%標(biāo)準(zhǔn)）。靈敏度分析顯示，雜質(zhì)含量為0.1%的樣品仍可穩(wěn)定檢出（Ct=34.2±0.5），且3次重復(fù)的CV=1.4%，表明熒光定量PCR儀的最低檢測(cè)限可達(dá)0.1%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)PCR-電泳法（檢測(cè)限>1%）。

（四）實(shí)際樣品檢測(cè)準(zhǔn)確性

6批商品種子的純度檢測(cè)結(jié)果。博清生物熒光定量PCR儀檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)SSR電泳法結(jié)果的相對(duì)偏差均小于5%（范圍1.2%-4.8%），且檢測(cè)周期由電泳法的2-3d縮短至4-6h，顯著提升了檢測(cè)效率。

（五）穩(wěn)定性與重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，8次平行擴(kuò)增的Ct值為28.6±0.4，CV=1.4%；批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)批次的Ct值分別為28.5±0.3、28.7±0.5、28.4±0.4，總 CV=0.9%。兩者CV值均小于3%，表明博清生物熒光定量PCR儀的檢測(cè)穩(wěn)定性良好，重復(fù)性優(yōu)異，可滿足批量樣品的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)需求。

三、討論

（一）博清熒光定量PCR儀在種子純度鑒定中的核心優(yōu)勢(shì)

本研究證實(shí)，博清生物熒光定量PCR儀在農(nóng)業(yè)種子純度鑒定中具有三大核心優(yōu)勢(shì)：

1、高精準(zhǔn)性：基于特異性SSR探針與多通道檢測(cè)，可有效區(qū)分近緣品種（如水稻“南粳46”與“南粳5055”），檢測(cè)限低至0.1%，可捕獲極低比例的雜質(zhì)種子，避免傳統(tǒng)方法的漏檢問(wèn)題；

2、高效性：優(yōu)化的反應(yīng)體系與儀器快速溫控模塊（升降溫速率6℃/s），使檢測(cè)周期縮短至4-6h，可滿足種子企業(yè)“隨到隨檢”的質(zhì)量控制需求，尤其適用于播種季前的緊急抽檢；

3、易用性：儀器配套的智能化分析軟件可自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算純度結(jié)果，并支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出與溯源，降低了對(duì)操作人員的技術(shù)要求，便于基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。

（二）與其他技術(shù)的對(duì)比與應(yīng)用場(chǎng)景拓展

相較于現(xiàn)有技術(shù)，熒光定量PCR儀應(yīng)用場(chǎng)景更廣泛：

1、對(duì)比形態(tài)學(xué)鑒定：無(wú)需等待種子萌發(fā)，可直接對(duì)干種子進(jìn)行檢測(cè)，不受生長(zhǎng)周期限制；

2、對(duì)比普通PCR-電泳：無(wú)需凝膠制備與染色，減少人為操作誤差，且可定量分析，而非僅定性判斷；

3、未來(lái)拓展：可通過(guò)設(shè)計(jì)多品種特異性探針，實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)體系中對(duì)多種作物種子的同時(shí)檢測(cè)（如水稻與玉米混合樣品），進(jìn)一步提升檢測(cè)效率。

（三）研究局限性與未來(lái)方向

本研究?jī)H驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在水稻、玉米中的應(yīng)用，對(duì)于棉花、大豆等其他作物，需進(jìn)一步優(yōu)化引物探針設(shè)計(jì)與反應(yīng)體系；此外，針對(duì)未知品種的雜質(zhì)鑒定，需結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建更全面的標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。未來(lái)可聯(lián)合博清生物開(kāi)發(fā)“儀器-試劑-試劑盒”一體化的種子純度檢測(cè)解決方案，推動(dòng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化落地。

本研究以博清生物科技（南京）有限公司熒光定量PCR儀為核心，建立了基于SSR標(biāo)記的種子純度鑒定技術(shù)體系。結(jié)果表明，該儀器在水稻、玉米種子純度檢測(cè)中具有特異性強(qiáng)、靈敏度高（檢測(cè)限0.1%）、準(zhǔn)確性好（相對(duì)偏差<5%）、穩(wěn)定性優(yōu)（CV<3%）及效率高（4-6h完成檢測(cè)）的特點(diǎn)，可有效解決傳統(tǒng)鑒定方法耗時(shí)、低效、準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。

博清生物熒光定量PCR儀為農(nóng)業(yè)種子純度鑒定提供了可靠的技術(shù)工具，可廣泛應(yīng)用于種子生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制、農(nóng)業(yè)行政監(jiān)管及生物技術(shù)育種科研領(lǐng)域，對(duì)保障種業(yè)安全、推動(dòng)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。