隨著工業(yè)化與農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展，重金屬、抗生素、持久性有機(jī)污染物等不斷進(jìn)入環(huán)境，通過(guò)食物鏈富集、微生物群落結(jié)構(gòu)改變、功能基因水平轉(zhuǎn)移等途徑，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及人類健康構(gòu)成潛在威脅。生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估作為環(huán)境管理的核心環(huán)節(jié)，需精準(zhǔn)識(shí)別污染物暴露水平與生態(tài)效應(yīng)的關(guān)聯(lián)，而傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法（如微生物培養(yǎng)法、化學(xué)儀器分析法）存在明顯局限：培養(yǎng)法僅能檢測(cè)可培養(yǎng)微生物，無(wú)法反映群落真實(shí)功能；化學(xué)法雖能定量污染物總量，但難以評(píng)估其生物有效性及對(duì)微生物代謝功能的影響。

熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的定量分析，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短等優(yōu)勢(shì)。博清生物科技（南京）有限公司作為國(guó)內(nèi)分子診斷設(shè)備領(lǐng)軍企業(yè)，其研發(fā)的熒光定量PCR儀優(yōu)化了光學(xué)系統(tǒng)與溫控模塊，支持5通道同時(shí)檢測(cè)，可滿足多靶點(diǎn)同步分析需求，且具備智能化操作界面與數(shù)據(jù)溯源功能，適合環(huán)境樣品的高通量檢測(cè)。

一、材料與方法

（一）研究區(qū)域與樣品采集

選取3類典型研究區(qū)域：

1、工業(yè)污染區(qū)（IP）：某化工園區(qū)廢水排放口下游0-1000m水體及周邊500m農(nóng)田土壤；

2、農(nóng)業(yè)種植區(qū)（AG）：長(zhǎng)期施用化肥（N-P-K復(fù)合肥）與抗生素類農(nóng)藥（如四環(huán)素類）的農(nóng)田土壤；

3、對(duì)照區(qū)（CK）：遠(yuǎn)離污染源的自然保護(hù)區(qū)水體與土壤。

樣品采集方法參照《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》：

1、水樣：采用有機(jī)玻璃采水器采集表層（0.5m）、中層（2m）、底層（4m）水樣，混合后取1L，經(jīng)0.22μm 聚醚砜濾膜過(guò)濾，濾膜置于-20℃保存；

2、土壤樣：采用五點(diǎn)采樣法采集0-20cm表層土壤，每點(diǎn)取100g，混合后過(guò)2mm篩，去除雜質(zhì)，分裝備用（-20℃保存）。每個(gè)區(qū)域設(shè)3個(gè)重復(fù)采樣點(diǎn)，共采集樣品36份（水體18份、土壤18份）。

（二）儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物熒光定量PCR儀；

2、輔助儀器：高速冷凍離心機(jī)、超純水儀、核酸提取儀；

3、試劑：土壤/水體微生物DNA提取試劑盒、TaqMan探針qPCR預(yù)混液、目標(biāo)基因特異性引物探針、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣品前處理與DNA提取

水樣：將冷凍保存的濾膜剪碎，加入裂解液，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物總DNA提??；

土壤樣：稱取0.5g土壤樣品，去除腐殖質(zhì)后，采用核酸提取儀自動(dòng)化提取總DNA。提取的DNA檢測(cè)純度，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2、qPCR反應(yīng)體系與程序設(shè)置

基于博清生物熒光定量PCR儀，構(gòu)建20μL qPCR反應(yīng)體系：10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，探針0.4μL，DNA模板2μL，無(wú)酶水6μL?？瞻讓?duì)照以無(wú)酶水替代模板，每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。

反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 3min；變性95℃ 10s，退火延伸60℃ 30s（采集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析（60-95℃，升溫速率0.5℃/s）。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建與儀器性能驗(yàn)證

將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)（R2）與擴(kuò)增效率。

驗(yàn)證博清生物熒光定量PCR儀的靈敏度（最低檢測(cè)限）、重復(fù)性（批內(nèi)、批間Ct值變異系數(shù)，CV）與特異性（溶解曲線單峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增）。

二、結(jié)果與分析

（一）博清生物熒光定量PCR儀性能驗(yàn)證結(jié)果

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增效率

3種目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系：cadA基因 R2=0.998，E=98.2%；tetA基因 R2=0.997，E=96.5%；amoA基因R2=0.999，E=101.3%。擴(kuò)增效率均處于90%-110% 的理想范圍，表明儀器定量準(zhǔn)確性滿足環(huán)境樣品檢測(cè)需求。

2、靈敏度與重復(fù)性

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)3種基因的最低檢測(cè)限均達(dá)10拷貝/μL，且當(dāng)模板濃度為10拷貝/μL時(shí)，Ct值變異系數(shù)<3%（n=3），表明儀器具備高靈敏度。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，同一樣品3次重復(fù)的Ct值CV為1.2%-1.8%；批間重復(fù)性試驗(yàn)（連續(xù)3天檢測(cè)）的Ct值CV為1.5%-2.0%，均<2%，證實(shí)儀器檢測(cè)穩(wěn)定性優(yōu)異。

3、特異性

溶解曲線分析顯示，3種目標(biāo)基因均呈現(xiàn)單一峰值，無(wú)引物二聚體或非特異性擴(kuò)增峰，表明引物探針設(shè)計(jì)合理，儀器光學(xué)系統(tǒng)可精準(zhǔn)區(qū)分不同熒光信號(hào)，特異性良好。

（二）不同區(qū)域目標(biāo)基因豐度分布

1、水體樣品

工業(yè)污染區(qū)（IP）水體中cadA基因與tetA基因豐度顯著高于對(duì)照區(qū)（CK）：IP區(qū)cadA基因豐度為（2.47×10?±1.23×10?）拷貝/L，是CK區(qū)（3.00×10?±2.15×103）的82.3倍；tetA基因豐度為（1.97×10?±1.05×10?）拷貝/L，是CK區(qū)（3.00×10?±1.87×103）的65.7倍（P<0.01）。農(nóng)業(yè)種植區(qū)（AG）水體中tetA基因豐度為（4.50×10?±2.31×10?）拷貝/L，是CK區(qū)的15.0倍（P<0.05），cadA基因豐度與CK區(qū)無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2、土壤樣品

IP區(qū)土壤中amoA基因豐度為（1.26×10?±8.50×103）拷貝/g，僅為CK區(qū)（4.00×10?±2.50×10?）的31.5%（P<0.01），表明工業(yè)污染抑制硝化細(xì)菌活性；AG區(qū)土壤中tetA基因豐度為（8.40×10?±4.20×10?）拷貝/g，是CK區(qū)（6.00×10?±3.10×103）的14.0倍（P<0.01），amoA基因豐度為（2.80×10?±1.50×10?）拷貝/g，顯著低于CK區(qū)（P<0.05）。

（三）生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

基于ERI模型計(jì)算，不同區(qū)域生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)差異顯著：

1、IP區(qū)：水體ERI=0.87，土壤ERI=0.82，均為高風(fēng)險(xiǎn)，主要風(fēng)險(xiǎn)源于重金屬與抗生素復(fù)合污染導(dǎo)致的抗性基因富集及功能微生物抑制；

2、AG區(qū)：土壤ERI=0.52，為中風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)以tetA基因?yàn)橹鳎ɑ兽r(nóng)藥施用導(dǎo)致抗生素抗性基因擴(kuò)散）；水體ERI=0.28，為低風(fēng)險(xiǎn)；

3、CK區(qū)：水體與土壤ERI均<0.3，為低風(fēng)險(xiǎn)，生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定。

三、討論

（一）博清生物熒光定量PCR儀在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

相較于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，博清生物熒光定量PCR儀在環(huán)境樣品分析中展現(xiàn)三大核心優(yōu)勢(shì)：

1、高靈敏度與定量精度：最低檢測(cè)限達(dá)10拷貝/μL，可捕獲環(huán)境中低豐度抗性基因與功能基因，解決傳統(tǒng)培養(yǎng)法“漏檢”問(wèn)題；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.995，確?；蜇S度定量準(zhǔn)確，為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠數(shù)據(jù)基礎(chǔ)；

2、高效性與高通量：支持96孔板與 5通道同步檢測(cè)，單批樣品（36份）檢測(cè)周期僅需2.5h，較普通PCR（需后續(xù)電泳定量）效率提升3-4倍，適合大規(guī)模環(huán)境普查；

3、智能化與易用性：配備LIMS數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，可自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算基因豐度及導(dǎo)出報(bào)告，減少人為操作誤差；觸摸屏操作界面簡(jiǎn)化流程，降低非專業(yè)人員使用門檻，便于在基層環(huán)境監(jiān)測(cè)站推廣。

（二）生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果的環(huán)境意義

工業(yè)污染區(qū)高ERI值表明，重金屬（如鎘）與抗生素（如四環(huán)素）的復(fù)合暴露可顯著促進(jìn)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，而amoA基因豐度降低則意味著硝化作用減弱，可能導(dǎo)致土壤氮循環(huán)失衡，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)與水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程。農(nóng)業(yè)種植區(qū)tetA基因富集提示，抗生素類農(nóng)藥的不合理使用可能成為抗性基因進(jìn)入環(huán)境的重要途徑，需加強(qiáng)農(nóng)藥使用管控。

（三）研究局限性與未來(lái)方向

本研究?jī)H選取3類目標(biāo)基因，未來(lái)可結(jié)合宏基因組學(xué)技術(shù)，利用博清生物熒光定量PCR儀的多通道優(yōu)勢(shì)，同步檢測(cè)更多污染物指示基因，構(gòu)建更全面的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系；此外，可開(kāi)展長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，分析基因豐度變化與生態(tài)效應(yīng)的時(shí)間關(guān)聯(lián)，提升風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀具備高靈敏度、高重復(fù)性與高特異性，可高效、準(zhǔn)確定量環(huán)境中的抗性基因與功能基因，滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)分子標(biāo)志物檢測(cè)的技術(shù)需求。

基于該儀器的檢測(cè)數(shù)據(jù)構(gòu)建的ERI模型，可有效量化工業(yè)污染區(qū)、農(nóng)業(yè)種植區(qū)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，明確污染來(lái)源與風(fēng)險(xiǎn)貢獻(xiàn)因子。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀為環(huán)境監(jiān)測(cè)與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了可靠的分子生物學(xué)工具，建議在環(huán)境管理與科研領(lǐng)域進(jìn)一步推廣應(yīng)用，為生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與污染防控提供技術(shù)支撐。