厭氧發(fā)酵技術(shù)是生物制藥領(lǐng)域的核心工藝之一，廣泛應(yīng)用于抗生素（如頭孢菌素前體）、益生菌制劑（如雙歧桿菌疫苗）、功能性小分子（如短鏈脂肪酸）等產(chǎn)品的研發(fā)與生產(chǎn)。其核心需求在于構(gòu)建嚴(yán)格厭氧、參數(shù)穩(wěn)定的微環(huán)境——若O?殘留量＞0.1%，會導(dǎo)致厭氧菌株呼吸鏈阻斷；溫度波動±1℃以上，將抑制菌體酶活；CO?濃度失衡則會破壞培養(yǎng)基pH緩沖體系，最終導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降30%以上。

傳統(tǒng)普通厭氧培養(yǎng)箱存在三大局限：一是依賴氮?dú)庵脫Q實(shí)現(xiàn)厭氧，O?殘留量難以穩(wěn)定控制在0.05%以下；二是溫度控制精度僅±0.5℃，且腔體內(nèi)溫度分布不均；三是缺乏CO?實(shí)時調(diào)控模塊，無法匹配菌株代謝對氣體配比的動態(tài)需求。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱針對上述痛點(diǎn)設(shè)計(jì)，集成了“真空-氮?dú)庵脫Q-氧氣催化”三級厭氧系統(tǒng)、PID智能控溫模塊及混合氣體精準(zhǔn)配比單元，但其在厭氧發(fā)酵生物制藥中的具體應(yīng)用效果尚未有系統(tǒng)研究。

本研究以產(chǎn)SCFAs的梭狀芽孢桿菌為模式菌株，通過對比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該設(shè)備對菌體生長、產(chǎn)物合成及發(fā)酵穩(wěn)定性的調(diào)控作用，為其在生物制藥科研及中試階段的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、菌株：梭狀芽孢桿菌，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，用于生產(chǎn)SCFAs。

2、培養(yǎng)基：庖肉培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min后冷卻至室溫。

3、核心設(shè)備：博清生物三氣培養(yǎng)箱；普通厭氧培養(yǎng)箱；高效液相色譜儀；紫外分光光度計(jì)。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、發(fā)酵體系構(gòu)建

菌株活化：將梭狀芽孢桿菌凍干粉接種至庖肉培養(yǎng)基，在博清生物三氣培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h（37℃，O?≤0.05%，N? 100%），獲得對數(shù)期種子液。

發(fā)酵接種：將種子液按5%（v/v）接種量接入500mL三角瓶（裝液量200mL），分別置于博清生物三氣培養(yǎng)箱（實(shí)驗(yàn)組）與普通厭氧培養(yǎng)箱（對照組）中，設(shè)定發(fā)酵參數(shù)：溫度37℃，濕度80% RH，實(shí)驗(yàn)組CO?/N?=5%/95%，對照組無CO?調(diào)控（僅N?平衡）。

2、參數(shù)監(jiān)測與檢測

環(huán)境參數(shù)監(jiān)測：每隔2h記錄兩組培養(yǎng)箱的腔體內(nèi)溫度、O?濃度、CO?濃度，計(jì)算24h內(nèi)參數(shù)波動范圍。

菌體生長檢測：每隔4h取樣，用紫外分光光度計(jì)測OD???值，繪制生長曲線；采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落形成單位（CFU/mL）。

產(chǎn)物檢測：發(fā)酵72h后，取樣離心（8000r/min，10min），上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用HPLC檢測SCFAs濃度。

重復(fù)性驗(yàn)證：兩組分別進(jìn)行3次平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，計(jì)算菌體濃度、SCFAs產(chǎn)量的CV值。

二、結(jié)果與分析

（一）培養(yǎng)箱環(huán)境參數(shù)穩(wěn)定性對比

博清生物三氣培養(yǎng)箱與普通厭氧培養(yǎng)箱的24h參數(shù)波動情況。實(shí)驗(yàn)組溫度波動僅±0.08℃，O?濃度穩(wěn)定在0.03%-0.05%，CO?濃度精準(zhǔn)維持在5.0%±0.05%；對照組溫度波動達(dá)±0.45℃，O?濃度波動范圍0.12%-0.28%，且無CO?調(diào)控能力。這表明博清生物三氣培養(yǎng)箱的多參數(shù)協(xié)同控制精度顯著優(yōu)于普通培養(yǎng)箱，可滿足厭氧發(fā)酵對微環(huán)境穩(wěn)定性的嚴(yán)苛需求。

（二）菌體生長情況分析

實(shí)驗(yàn)組菌體在12h進(jìn)入對數(shù)期，28h達(dá)到穩(wěn)定期，最大OD???值為2.86，CFU/mL為1.92×10?；對照組在18h才進(jìn)入對數(shù)期，34h達(dá)到穩(wěn)定期，最大OD???值為2.32，CFU/mL為1.56×10?。

關(guān)鍵原因分析：博清培養(yǎng)箱的低氧環(huán)境（O?≤0.05%）減少了菌體的氧化應(yīng)激損傷，提前啟動對數(shù)期增殖；精準(zhǔn)控溫避免了酶活波動，而CO?的穩(wěn)定供給則維持了培養(yǎng)基pH在6.8-7.0的最佳范圍，進(jìn)一步促進(jìn)菌體代謝。

（三）SCFAs合成效率對比

發(fā)酵72h后，實(shí)驗(yàn)組SCFAs總產(chǎn)量為16.8g/L（其中丁酸12.5g/L，乙酸4.3g/L），對照組總產(chǎn)量為14.2g/L（丁酸10.3g/L，乙酸3.9g/L），實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量提升18.2%。這是因?yàn)镾CFAs合成依賴于菌體的乙酰輔酶A代謝通路，博清培養(yǎng)箱的穩(wěn)定微環(huán)境提高了關(guān)鍵酶（如丁酸激酶）的活性，同時減少了代謝中間產(chǎn)物的流失。

（四）發(fā)酵過程重復(fù)性驗(yàn)證

3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組菌體濃度的CV值為2.8%，SCFAs產(chǎn)量的CV值為3.1%；對照組菌體濃度CV值為7.5%，SCFAs產(chǎn)量CV值為8.3%。博清生物三氣培養(yǎng)箱的低變異系數(shù)表明其可顯著提升厭氧發(fā)酵的重復(fù)性，這對生物制藥科研中“實(shí)驗(yàn)結(jié)果可復(fù)現(xiàn)”及中試放大的“工藝穩(wěn)定性”至關(guān)重要。

三、討論

本研究證實(shí)，博清生物三氣培養(yǎng)箱通過三大核心優(yōu)勢提升厭氧發(fā)酵生物制藥效率：

（一）三級厭氧系統(tǒng)：采用“真空抽除-氮?dú)庵脫Q-鈀催化劑除氧”流程，將O?殘留量控制在0.05%以下，解決了普通培養(yǎng)箱“厭氧不徹底”導(dǎo)致的菌體活性低問題；

（二）PID智能控溫：通過腔體內(nèi)多點(diǎn)溫度傳感器實(shí)時反饋，控溫精度達(dá)±0.1℃，避免了溫度波動對酶活的抑制，縮短菌體延遲期；

（三）動態(tài)氣體配比：可根據(jù)菌株代謝需求靈活調(diào)整CO?/N?比例，本研究中5% CO?的設(shè)定恰好匹配梭狀芽孢桿菌的pH緩沖需求，減少了培養(yǎng)基酸堿調(diào)節(jié)帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)。

與現(xiàn)有研究對比，使用某品牌三氣培養(yǎng)箱雖能將SCFAs產(chǎn)量提升12%，但O?控制精度僅±0.08%，而博清生物三氣培養(yǎng)箱的O?精度達(dá)±0.03%，進(jìn)一步降低了氧化損傷；同時，該設(shè)備集成的觸摸屏與數(shù)據(jù)記錄功能（可導(dǎo)出溫度、氣體濃度的實(shí)時曲線），為生物制藥科研的“工藝追溯”提供了便利。

本研究的局限性在于僅針對梭狀芽孢桿菌展開，未來可擴(kuò)展至雙歧桿菌、產(chǎn)甲烷菌等其他厭氧制藥菌株，進(jìn)一步驗(yàn)證設(shè)備的通用性；同時可結(jié)合響應(yīng)面法，優(yōu)化不同菌株對應(yīng)的最佳氣體配比與溫度參數(shù)，形成“菌株-設(shè)備參數(shù)”匹配數(shù)據(jù)庫。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱可通過精準(zhǔn)控制溫度、厭氧度及氣體配比，為厭氧發(fā)酵生物制藥構(gòu)建穩(wěn)定的微環(huán)境。在梭狀芽孢桿菌產(chǎn)SCFAs的實(shí)驗(yàn)中，該設(shè)備使菌體對數(shù)期提前6h，最大菌體濃度提升23.5%，SCFAs產(chǎn)量提高18.2%，且發(fā)酵重復(fù)性（CV值3.1%）顯著優(yōu)于普通厭氧培養(yǎng)箱。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的三氣培養(yǎng)箱可作為厭氧發(fā)酵生物制藥科研、中試階段的核心設(shè)備，為提升發(fā)酵效率、保障工藝穩(wěn)定性提供關(guān)鍵技術(shù)支撐，具有廣闊的應(yīng)用前景。