豬繁殖與呼吸綜合征（豬藍(lán)耳病，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度傳染性疫病，以母豬繁殖障礙（流產(chǎn)、死胎）和仔豬呼吸道癥狀為主要特征，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。該病的早期精準(zhǔn)診斷是防控關(guān)鍵，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）因操作簡便、成本可控、適合批量檢測(cè)，成為 PRRS 抗體篩查的主流技術(shù)。

酶標(biāo)儀作為ELISA檢測(cè)的核心設(shè)備，其檢測(cè)精度、穩(wěn)定性直接決定診斷結(jié)果可靠性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀作為國產(chǎn)主流設(shè)備，具備多通道檢測(cè)、智能數(shù)據(jù)分析等功能，但目前針對(duì)其在豬藍(lán)耳病診斷中的專項(xiàng)性能評(píng)估研究較少。本研究通過臨床樣本檢測(cè)，對(duì)比進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀，系統(tǒng)驗(yàn)證博清生物酶標(biāo)儀在豬藍(lán)耳病ELISA診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床檢測(cè)提供數(shù)據(jù)支持。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、樣本來源：150份豬血清樣本均來自河南、山東等地規(guī)模化豬場(chǎng)，涵蓋仔豬（30日齡內(nèi)）、育肥豬（120日齡左右）及成年母豬，樣本采集后- 20℃冷凍保存，檢測(cè)前室溫解凍并充分混勻。

2、檢測(cè)試劑盒：豬藍(lán)耳病抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，符合GB/T 27982-2011《豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)。

3、儀器設(shè)備：博清生物酶標(biāo)儀；標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀，作為對(duì)照儀器；移液器、恒溫孵育箱等。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本處理：將冷凍血清樣本室溫解凍后，3000r/min離心5min，取上清液備用，避免溶血樣本參與檢測(cè)。

2、ELISA操作：嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟如下：

加樣：每孔加入稀釋后的血清樣本100μL，空白孔加稀釋液100μL，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各設(shè)3孔，37℃孵育60min；

洗板：用洗滌液洗板5次，每次浸泡30s，拍干殘留液體；

加酶標(biāo)二抗：每孔加酶標(biāo)二抗100μL，37℃孵育30min，重復(fù)洗板步驟；

顯色：每孔加底物液A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

終止：每孔加終止液50μL，10min內(nèi)完成酶標(biāo)儀檢測(cè)。

3、酶標(biāo)儀檢測(cè)：分別使用博清生物酶標(biāo)儀和對(duì)照酶標(biāo)儀，在450nm波長下讀取各孔OD值，計(jì)算樣本S/P值（S為樣本OD值，P為陽性對(duì)照平均OD值）。判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P≥0.4為陽性，S/P<0.4為陰性。

4、數(shù)據(jù)分析：采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算博清生物酶標(biāo)儀與對(duì)照儀器的檢測(cè)一致性（Kappa值）、靈敏度（真陽性率）、特異性（真陰性率）；選取10份陽性樣本、10份陰性樣本，重復(fù)檢測(cè)3次（批內(nèi)）、連續(xù)檢測(cè)3天（批間），計(jì)算變異系數(shù)（CV）評(píng)估重復(fù)性。

二、結(jié)果

（一）檢測(cè)結(jié)果一致性

150份血清樣本經(jīng)兩臺(tái)儀器檢測(cè)，結(jié)果顯示博清生物酶標(biāo)儀檢出陽性樣本57份、陰性樣本93份；進(jìn)口對(duì)照酶標(biāo)儀檢出陽性樣本58份、陰性樣本92份。兩臺(tái)儀器檢測(cè)結(jié)果一致的樣本共147份，一致性率為98.0%，Kappa值為0.95（Kappa>0.75，表明一致性極佳）。

（二）靈敏度與特異性

以進(jìn)口對(duì)照酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計(jì)算博清生物酶標(biāo)儀的診斷性能：

靈敏度=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)）=55/（55+2）=96.5%

特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）=92/（92+1）=98.9%

假陽性率=1-特異性=1.1%，假陰性率=1-靈敏度=3.5%

（三）重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，博清生物酶標(biāo)儀檢測(cè)陽性樣本OD值的CV為1.2%~2.1%，陰性樣本CV為1.5%~2.3%；批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，陽性樣本CV為1.5%~2.5%，陰性樣本CV為1.8%~2.8%，均低于ELISA檢測(cè)要求的CV≤5%標(biāo)準(zhǔn)，表明儀器重復(fù)性良好。

三、討論

本研究從一致性、診斷性能、重復(fù)性三個(gè)維度，系統(tǒng)評(píng)估了博清生物酶標(biāo)儀在豬藍(lán)耳病ELISA診斷中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果顯示該儀器具備以下優(yōu)勢(shì)：

（一）檢測(cè)一致性高：與進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀的一致性率達(dá)98.0%，Kappa值0.95，說明其檢測(cè)結(jié)果可與國際主流儀器對(duì)標(biāo)，避免因儀器差異導(dǎo)致的診斷偏差，適合臨床批量樣本篩查。

（二）診斷性能可靠：靈敏度96.5%、特異性98.9%，假陰性率僅3.5%，可有效減少“漏診”風(fēng)險(xiǎn)（尤其針對(duì)早期感染豬只）；假陽性率1.1%，降低“誤判”導(dǎo)致的過度防控成本，符合豬藍(lán)耳病防控中“早發(fā)現(xiàn)、少誤判”的需求。

（三）穩(wěn)定性強(qiáng)：批內(nèi)、批間CV均低于5%，表明儀器在多次檢測(cè)、不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)中性能穩(wěn)定，不受操作環(huán)境（如室溫波動(dòng)）的輕微影響，適合基層實(shí)驗(yàn)室長期使用。

對(duì)比同類研究，國產(chǎn)酶標(biāo)儀在豬疫病診斷中的性能已逐步接近進(jìn)口儀器，且博清生物酶標(biāo)儀還具備操作界面簡潔（支持中文）、檢測(cè)速度快（每板檢測(cè)時(shí)間≤5min）、維護(hù)成本低等優(yōu)勢(shì)，更適配我國基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的使用場(chǎng)景。

本研究的局限性在于樣本來源集中于華北地區(qū)，后續(xù)可擴(kuò)大樣本地域范圍（如南方高濕地區(qū)），并結(jié)合PRRSV不同基因型（如經(jīng)典株、高致病性株）樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證儀器的普適性；同時(shí)可探索該儀器在豬藍(lán)耳病抗原ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用，拓展其診斷場(chǎng)景。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的酶標(biāo)儀在豬藍(lán)耳病抗體ELISA診斷中，具有檢測(cè)一致性高、靈敏度與特異性優(yōu)異、重復(fù)性穩(wěn)定的特點(diǎn)，且操作便捷、成本可控，能夠滿足臨床檢測(cè)與科研實(shí)驗(yàn)對(duì)豬藍(lán)耳病精準(zhǔn)診斷的需求，可作為國產(chǎn)酶標(biāo)儀在動(dòng)物疫病診斷領(lǐng)域的優(yōu)選設(shè)備之一。

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