一、研究背景

畜禽疫?。ㄈ绶侵挢i瘟、禽流感、藍(lán)耳病等）具有傳播速度快、致死率高、經(jīng)濟(jì)損失大等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)安全生產(chǎn)與公共衛(wèi)生安全。傳統(tǒng)診斷方法中，病毒分離培養(yǎng)操作復(fù)雜、耗時(shí)久（2-7天），難以滿足疫情應(yīng)急處置需求；膠體金免疫層析法雖快速簡(jiǎn)便，但靈敏度較低，易出現(xiàn)漏檢；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）靈敏度與特異性較高，但依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室與操作人員，設(shè)備成本高，不適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)兼具高靈敏度、高特異性與便攜性的快速診斷技術(shù)，成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)基于先進(jìn)的生物熒光檢測(cè)技術(shù)，整合微型光學(xué)系統(tǒng)、恒溫?cái)U(kuò)增模塊與智能數(shù)據(jù)分析模塊，可實(shí)現(xiàn)病原體核酸或抗原的快速定量檢測(cè)。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器設(shè)備：博清生物熒光計(jì)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；膠體金檢測(cè)試劑盒；高速冷凍離心機(jī)。

2、試劑與樣本：目標(biāo)病原體標(biāo)準(zhǔn)品；非目標(biāo)病原體（豬瘟病毒、新城疫病毒等5種）；臨床樣本共362份（包括豬血清186份、雞咽拭子124份、豬組織勻漿52份，采集某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)）；熒光探針（特異性針對(duì)目標(biāo)病原體基因保守區(qū)）；恒溫?cái)U(kuò)增試劑。

（二）檢測(cè)原理

博清生物熒光計(jì)采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，當(dāng)特異性熒光探針與目標(biāo)病原體核酸（或抗原）結(jié)合后，探針構(gòu)象發(fā)生改變，激發(fā)光能量從供體熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體熒光基團(tuán)，產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)。儀器通過(guò)微型光學(xué)傳感器捕捉熒光強(qiáng)度變化，結(jié)合內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)病原體的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果以“陽(yáng)性/陰性”及核酸拷貝數(shù)呈現(xiàn)。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本處理

血清樣本室溫靜置30min后，8000r/min離心5min取上清；組織勻漿樣本按1:5比例加入生理鹽水研磨，10000r/min離心10min取上清；咽拭子樣本置于含3mL PBS緩沖液的離心管中，振蕩10min后取上清。所有樣本均采用核酸提取試劑盒（磁珠法）提取核酸，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2、檢測(cè)體系優(yōu)化

以ASFV為模型，優(yōu)化熒光探針濃度（0.2-1.0μmol/L）、擴(kuò)增溫度（60-65℃）、反應(yīng)時(shí)間（20-40min）等參數(shù)，以熒光信號(hào)強(qiáng)度、檢測(cè)限為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)條件。

3、性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

靈敏度檢測(cè)：將目標(biāo)病原體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋（10?-10?copies/μL），分別采用博清生物熒光計(jì)、qPCR儀、膠體金試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，記錄最低檢測(cè)限。

特異性檢測(cè)：采用優(yōu)化后的檢測(cè)體系，對(duì)5種非目標(biāo)病原體及3種目標(biāo)病原體進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證儀器特異性。

檢測(cè)速度對(duì)比：統(tǒng)計(jì)3種方法從樣本處理到獲得結(jié)果的總時(shí)間。

臨床樣本驗(yàn)證：采用3種方法對(duì)362份臨床樣本進(jìn)行平行檢測(cè)，以qPCR檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算博清生物熒光計(jì)的檢測(cè)符合率、靈敏度、特異度。

三、結(jié)果與分析

（一）檢測(cè)體系優(yōu)化結(jié)果

當(dāng)熒光探針濃度為0.6μmol/L、擴(kuò)增溫度為63℃、反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，博清生物熒光計(jì)對(duì)ASFV標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)強(qiáng)度最高，背景噪音最低，確定為最佳反應(yīng)條件。

（二）靈敏度檢測(cè)結(jié)果

博清生物熒光計(jì)對(duì)ASFV、AIV-H9、PRRSV的最低檢測(cè)限均為101copies/μL，qPCR儀檢測(cè)限為10?copies/μL，膠體金試劑盒檢測(cè)限為103copies/μL。博清生物熒光計(jì)靈敏度雖略低于qPCR，但較膠體金方法提升100倍。

（三）特異性檢測(cè)結(jié)果

博清生物熒光計(jì)僅對(duì)ASFV、AIV-H9、PRRSV產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)，與豬瘟病毒、新城疫病毒等5種非目標(biāo)病原體無(wú)交叉反應(yīng)，特異性達(dá)100%，與qPCR檢測(cè)結(jié)果一致。

（四）檢測(cè)速度對(duì)比結(jié)果

博清生物熒光計(jì)單個(gè)樣本從處理到出結(jié)果的總時(shí)間為35min，其中樣本處理15min、擴(kuò)增檢測(cè)20min；qPCR總時(shí)間為90min（樣本處理30min、擴(kuò)增檢測(cè)60min）；膠體金總時(shí)間為25min，但需手動(dòng)判讀結(jié)果，主觀性較強(qiáng)。

（五）臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果

362份臨床樣本中，qPCR檢測(cè)陽(yáng)性128份、陰性234份。博清生物熒光計(jì)檢測(cè)陽(yáng)性126份、陰性236份，與qPCR檢測(cè)結(jié)果的總符合率為98.2%（356/362），靈敏度為98.4%（126/128），特異度為98.3%（230/234），與膠體金方法（符合率91.7%）相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.36，P<0.01）。

四、討論

本研究構(gòu)建的博清生物熒光計(jì)畜禽疫病檢測(cè)體系，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV、AIV-H9、PRRSV等常見(jiàn)疫病的快速精準(zhǔn)檢測(cè)。結(jié)果顯示，該儀器靈敏度較膠體金方法大幅提升，接近qPCR水平，可有效減少漏檢風(fēng)險(xiǎn)；特異性達(dá)100%，避免了交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤判，為疫情精準(zhǔn)防控提供可靠依據(jù)。

在檢測(cè)效率方面，博清生物熒光計(jì)將單個(gè)樣本檢測(cè)周期控制在35min內(nèi)，較傳統(tǒng)qPCR縮短60%以上，且無(wú)需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，儀器重量?jī)H0.5kg，配備觸摸屏操作界面與藍(lán)牙數(shù)據(jù)傳輸功能，適合養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查與基層防疫部門移動(dòng)檢測(cè)。此外，該儀器采用一次性反應(yīng)芯片，避免交叉污染，檢測(cè)成本僅為qPCR的1/3，符合規(guī)?；B(yǎng)殖與基層防疫的成本控制需求。

與現(xiàn)有研究相比，本研究首次系統(tǒng)驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)在多種畜禽疫病診斷中的應(yīng)用性能，覆蓋豬、禽等主要養(yǎng)殖品種，臨床樣本量較大，結(jié)果可靠性更高。但本研究?jī)H針對(duì)3種常見(jiàn)疫病，后續(xù)可擴(kuò)展至牛、羊等畜禽疫病檢測(cè)，進(jìn)一步優(yōu)化多通道檢測(cè)模塊，實(shí)現(xiàn)多種病原體的同步篩查。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光計(jì)憑借高靈敏度、高特異性、快速便捷、成本可控等優(yōu)勢(shì)，在畜禽疫病診斷中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。該儀器可有效解決傳統(tǒng)診斷方法在基層應(yīng)用中的痛點(diǎn)，為畜牧業(yè)疫病早發(fā)現(xiàn)、早處置提供技術(shù)支撐，對(duì)保障畜牧業(yè)健康發(fā)展與公共衛(wèi)生安全具有重要意義。未來(lái)可通過(guò)技術(shù)迭代，進(jìn)一步提升多病原體同步檢測(cè)能力，拓展在畜禽疫病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用場(chǎng)景。