全球化背景下，新發(fā)突發(fā)傳染病頻發(fā)對(duì)公共衛(wèi)生應(yīng)急體系提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，流行病學(xué)溯源作為疫情防控的核心環(huán)節(jié)，需快速明確病原體基因型特征、傳播鏈及變異趨勢(shì)，為精準(zhǔn)防控提供科學(xué)依據(jù)。熒光定量PCR技術(shù)因具備高靈敏度、特異性及實(shí)時(shí)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，已成為病原體檢測(cè)與溯源的核心技術(shù)平臺(tái)。博清生物科技（南京）有限公司自主研發(fā)的熒光定量PCR儀系列產(chǎn)品，整合多重?zé)晒鈾z測(cè)、精準(zhǔn)溫控等關(guān)鍵技術(shù)，適配不同應(yīng)用場(chǎng)景需求。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物熒光定量PCR儀，配套熒光定量分析軟件；

2、試劑：病毒/細(xì)菌核酸提取試劑盒、多重?zé)晒舛縋CR試劑盒；

3、標(biāo)準(zhǔn)品與對(duì)照：BRV、BCoV、K99標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC編號(hào)分別為VR-99、VR-808、ATCC 25944），人蒼白桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC 45234），陰性對(duì)照為無酶純水。

（二）實(shí)驗(yàn)樣本

1、臨床樣本：126份牧區(qū)發(fā)熱患者血液樣本、89份腹瀉患者糞便樣本（來源于某三級(jí)醫(yī)院傳染病科）；

2、環(huán)境樣本：60份農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境涂抹樣本、45份飲用水樣本；

3、溯源驗(yàn)證樣本：某地區(qū)聚集性疫情相關(guān)的32份密切接觸者咽拭子樣本。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1、核酸提取

采用博清生物核酸提取試劑盒，按照說明書操作提取樣本核酸，熒光計(jì)定量（1-20μL 樣本體積），確保核酸濃度≥5ng/μL，純度A260/A280為1.8-2.0。

2、多重?zé)晒舛縋CR體系建立

基于目標(biāo)病原體基因序列（GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載），設(shè)計(jì)特異性引物與探針（DNAstar V7.1 軟件），優(yōu)化反應(yīng)體系：2×PCR Mix10μL，引物混合物（10μmol/L）2μL，探針混合物（5μmol/L）1μL，模板核酸2μL，補(bǔ)水至20μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3min；95℃ 10s，退火溫度58-62℃（梯度優(yōu)化）30s，40個(gè)循環(huán)，六通道同時(shí)采集熒光信號(hào)。

3、方法學(xué)驗(yàn)證

靈敏度：對(duì)10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，記錄最低檢出濃度；

特異性：交叉檢測(cè)其他常見病原體（如沙門氏菌、甲型流感病毒等），驗(yàn)證無交叉反應(yīng)；

重復(fù)性：對(duì)同一批樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算Ct值變異系數(shù)（CV）。

4、流行病學(xué)溯源分析

結(jié)合樣本采集時(shí)間、空間分布及Ct值數(shù)據(jù)，通過MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析病原體基因型特征，追溯傳播鏈；利用儀器配套軟件進(jìn)行病毒載量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，評(píng)估傳播風(fēng)險(xiǎn)。

二、結(jié)果

（一）儀器性能驗(yàn)證

博清生物熒光定量PCR儀在六通道檢測(cè)模式下，各通道熒光信號(hào)無交叉干擾（CV<1.2%）；精準(zhǔn)溫控系統(tǒng)使孔間溫度差≤±0.3℃，循環(huán)閾值（Ct）重復(fù)性良好（CV<2.0%）。8孔/16孔型號(hào)在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，單批次樣本檢測(cè)時(shí)間≤90min，適配移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急需求。

（二）檢測(cè)靈敏度與特異性

建立的三重?zé)晒舛縋CR體系對(duì)BRV、BCoV、K99的最低檢測(cè)限分別為3.8fg/μL、4.2fg/μL、5.1fg/μL，人蒼白桿菌最低檢測(cè)限達(dá)3.67fg/μL（Ct=36.40）；與15種非目標(biāo)病原體無交叉反應(yīng)，特異性達(dá)99.2%。

（三）流行病學(xué)溯源效能

1、臨床樣本檢測(cè)：126份血液樣本中人蒼白桿菌檢出率17.46%（22/126），89份糞便樣本中BRV、BCoV、K99聯(lián)合檢出率24.72%（22/89），與測(cè)序結(jié)果一致性達(dá)98.3%；

2、環(huán)境樣本溯源：從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣本中檢出2株BCoV陽(yáng)性，基因型與同期臨床病例分離株同源性99.5%，明確環(huán)境傳播途徑；

3、聚集性疫情追蹤：通過32份密切接觸者樣本的基因分型與病毒載量監(jiān)測(cè)，成功構(gòu)建3條傳播鏈，識(shí)別出2名隱性感染者為傳播源頭，為防控措施調(diào)整提供依據(jù)。

三、討論

流行病學(xué)溯源的核心需求是快速明確病原體“來源-傳播-變異”鏈條，熒光定量PCR技術(shù)作為分子溯源的關(guān)鍵工具，其檢測(cè)性能直接影響防控效率。博清生物熒光定量PCR儀通過以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)適配公共衛(wèi)生應(yīng)急需求：

（一）多場(chǎng)景適配性：96孔高通道型號(hào)滿足大規(guī)模篩查需求，8孔/16孔便攜式型號(hào)適配現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急檢測(cè)，解決傳統(tǒng)儀器“實(shí)驗(yàn)室局限”問題，實(shí)現(xiàn)“臨床-環(huán)境-密切接觸者”全鏈條樣本同步檢測(cè)；

（二）高精準(zhǔn)檢測(cè)能力：六通道無干擾設(shè)計(jì)支持多重病原體同時(shí)檢測(cè)，結(jié)合自主研發(fā)的“實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)溫控技術(shù)”，顯著提升低載量樣本檢出率，為隱性感染溯源提供技術(shù)支撐；

（三）溯源效率提升：相較于傳統(tǒng)單重PCR，該儀器檢測(cè)時(shí)間縮短40%以上，配套軟件可直接輸出基因型分析與系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)，減少溯源分析周期，助力疫情快速處置。

本研究驗(yàn)證了該儀器在細(xì)菌、病毒類病原體溯源中的應(yīng)用價(jià)值，與相關(guān)研究結(jié)果一致。在聚集性疫情中，通過病毒載量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與基因分型結(jié)合，可精準(zhǔn)識(shí)別傳播源頭與風(fēng)險(xiǎn)人群，彌補(bǔ)傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查“時(shí)空模糊”的缺陷。此外，儀器兼容多種核酸提取試劑盒，降低基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用門檻，具備規(guī)?；茝V潛力。

局限性方面，本研究樣本量集中于特定地區(qū)，不同病原體的溯源效能需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證；未來可結(jié)合數(shù)字PCR、二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建“快速篩查-精準(zhǔn)溯源-變異監(jiān)測(cè)”一體化平臺(tái)，提升新發(fā)突發(fā)傳染病防控的前瞻性。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀憑借高靈敏度、多通道兼容及場(chǎng)景適配性優(yōu)勢(shì)，在病原體檢測(cè)、基因分型及傳播鏈追溯中表現(xiàn)優(yōu)異，可有效支撐公共衛(wèi)生應(yīng)急響應(yīng)與疫情流行病學(xué)溯源工作。該儀器的推廣應(yīng)用有助于提升基層實(shí)驗(yàn)室溯源能力，為疫情防控“早發(fā)現(xiàn)、早處置”提供關(guān)鍵技術(shù)保障，具有重要的公共衛(wèi)生價(jià)值。